|
|
|
|
2.1. Cicle cel.lular en dinoflagel.lades
INTRODUCCIÓ
En aquest capítol s'exposa la informació sobre espècies de dinoflagel·lades de les quals se n'ha estudiat el cicle cel·lular com a coneixement previ per aplicar el mètode de l'índex mitòtic i estimar la taxa de creixement.
Una de les premisses més importants per aplicar el model de creixement per cicle cel·lular és el coneixement de les fases del cicle cel·lular en les espècies de dinoflagel·lades, si es poden reconèixer, i el fet que es puguin estimar tots el paràmetres que imposa el model, des de saber si el cicle de divisió està en fase fins a distingir màxims de freqüències en fases consecutives.
Taula 2.1.1. Espècies estudiades per a l'obtenció de la taxa de creixement al camp i al laboratori en aquesta tesi. El mètode 1 es refereix a l'estudi al laboratori de les fases del cicle cel·lular SG2M, 2 es refereix a l'estudi en el camp de les fases del cicle cel·lular SG2M i 3 es refereix a l'estudi de les fases de cèl·lules binucleades, citocinesi i cèl·lules acabades de dividir. Els asteriscos representen les espècies en què s'ha pogut aplicar el model d'índex mitòtic per estimar la taxa de creixement. La font d'error més important per a l'estimació se senyala seguidament.
La metodologia general com s'exposa en el capítol 2 és fer mostretjos en períodes freqüents en cicles de llum i foscor que acostumen a ser de 24 hores. Es detalla la metodologia concreta específica per a algunes espècies. En la taula 2.1.1 s'exposen les diferentes espècies que s'han estudiat en aquesta tesi; part del treball d'aquestes espècies està exposada en capítols posteriors. L'altra part és l'informació del cicle cel·lular d'altres espècies estudiades.
En Dinophysis sacculus s'han estudiat les fases del cicle cel·lular de cèl·lules binucleades, cèl·lules en parella i cèl·lules acabades de dividir. Aquesta informació està exposada en el capítol 2.2. A més d'aquestes fases, posteriorment es varen estudiar les fases del cicle cel·lular S (replicació del DNA), G2 (espera abans de la divisió cel·lular) juntament amb la mitosi com mostren les figures 2.1.1 i 2.1.2 .
MATERIALS I MÈTODES
La metodologia utilitzada està exposada en el capítol 2. Els cicles es varen dur a terme els dies 20.10.94 i 8.2.95 al port de Sant Carles de la Ràpita. Les condicions d'aquests cicles estan exposades en el capítol 4.4.
RESULTATS I DISCUSSIÓ
Les fases S i G2M del cicle cel·lular de D. sacculus es presenten en fase, on es pot distingir un màxim i una seqüència d'aquests màxims en les dues fases consecutives estudiades (fig. 2.1.1 i 2.1.2). Per tant, l'estudi de les fases S i G2M en D. sacculus ens permet aplicar el model de creixement in situ per cicle cel·lular. Per al cicle realitzat el dia 20 d'octubre de 1994, la fase S té un màxim d'entre 5 i 6 hores després de la foscor i una durada de 4.7 hores, la fase G2M té el màxim 1 hora després de l'alba i una durada de 6.3 hores. La taxa de creixement in situ estimada és de 0.42 dia-1. Per al cicle realitzat el dia 8 de febrer de 1995, la fase S té un màxim 6 hores després de la foscor i una durada de 6.6 hores, la fase G2M té el màxim a l'alba i una durada de 5.3 hores. La taxa de creixement in situ estimada és de 0.32 dia-1.
DINOPHYSIS ACUMINATA
Les observacions que es varen fer en D. acuminata varen ser la freqüència de cèl·lules amb dos nuclis, les cèl·lules en parella i les cèl·lules acabades de dividir. Les condicions, material i mètodes del treball i els resultats de l'índex mitòtic en D. acuminata estan publicats en Bravo, I., Garcés, E. and Reguera, B. (1995). Calculation of in situ growth rates from fractions of cells undergoing mitosi. Report d'ICES/IOC-Workshop on "Intercomparison on in situ growth rate measurements" Aveiro, Portugal. Del 25 al 29 de juliol de 1994.
GYMNODINIUM CATENATUM
Gymnodinium catenatum és una dinoflagel·lada formadora de cadenes que produeix enverinament paralític per consum de mol·luscs bivalves (PSP) en diverses localitats, golf de California (Mee et al., 1986),aigües costaneres de la península Ibèrica, (Anderson et al., 1989, Franca i Almeida, 1989),Tasmania (Oshima et al., 1987) i Japó (Ikeda et al., 1989).A les aigües catalanes s'han donat proliferacions del Gyrodinium impudicum (Fraga et al., 1995)que és molt similar morfològicament a l'espècie anterior però no presenta la toxicitat PSP. És una dinoflagel·lada nua formadora de cadenes típicament de quatre cèl·lules (fig. 2.1.13), encara que també en podem observar cadenes més llargues. En general és més petita que el G. catenatum, però hi ha superposició de mides. L'episodi de desenvolupament de G. impudicum a la costa catalana més evident va ser l'estiu de 1993 quan va formar franges colorejades paralel·les a la costa, que es van estendre des de Mataró fins Barcelona. L'episodi més recent ha estat l'estiu del 1997. L'estudi del G. catenatum es deu a la necessitat de conèixer el tipus de divisió cel·lular i la possibilitat d'aplicar el mètode de taxa de creixement per cicle cel·lular. El fet de tenir el cultiu de G. catenatum va facilitar l'experimentació. Queda, però, pendent l'estudi de G. impudicum com a productor local de proliferacions massives. S'ha intentat estimar les fases del cicle de divisió de G. catenatum en concicions de cultius que poguessin servir d'indicador de la divisió, i també s'ha intentat estimar les durades d'aquestes fases per aplicar el model de creixement per cicle cel·lular. Es va intentar veure si el nombre de cèl·lules per cadena de G. catenatum en un cicle de 24 hores podria ser un marcador de la taxa de creixement en aquesta espècie i en general en espècies formadores de cadenes. MATERIAL I MÈTODES
Els cultius de G. catenatum varen créixer en un medi K a 16 i 19 ºC amb un cicle de llum i foscor de 16:8h amb una intensitat de llum de 150 µEm-2s-1 d'un fluorescent fred. Es varen mostrejar els cultius durant 24 hores en intervals de 2 hores. La fixació de les mostres i la tinció de DNA estan explicades en el capítol 2. Es varen quantificar les cèl·lules amb dos nuclis i les cèl·lules en citocinesi. La formació nova de cèl·lules dóna una aparença en ziga-zaga de les cadenes, i això és indicatiu de citocinesi.
RESULTATS I DISCUSSIÓ
Quant a les fases de la divisió cel·lular en G. catenatum, no es distingeix un màxim amb claredat. Les cèl·lules en mitosi que poseeixen doble nucli no es presenten en hores preferencials. Això ens ha passat amb D. sacculus i està exposat per altres espècies, atès que aquesta fase pot ser molt ràpida i difícil de veure. Les cèl·lules en citocinesi es presenten durant les primeres hores de la foscor i durant les 10 hores següents. A part que les freqüències són baixes no sembla que es donin màxims en aquest estat cel·lular. Per tant, això fa que no poguem aplicar el model de creixement per divisió cel·lular en aquesta espècie.
D'altra banda, G. catenatum té una tendència a formar cadenes de 4, 6 i 8 cèl·lules en cultius a 19 ºC mentre que a 16 ºC hi ha un 40 % de cèl·lules individuals i quasi la meitat de cadenes formades són de dues cèl·lules (fig. 2.1.4).
L'estimació de la longitud de les cadenes pot ser un indicador del creixement de l'organisme. Podria haver-hi una relació entre la longitud de les cadenes i la taxa de creixement. L'ocurrència d'unes condicions de creixement subòptim quan les cadenes són de 2 cèl.lules o estan en forma d'una de sola va ser ja proposada per Blackburn (1989). En cultius, les cadenes llargues es veuen en les poblacions que creixen bé. Si la formació de cadenes fos deguda al fet que les cèl·lules triguen més a separar-se que a dividir-se de nou, a una taxa alta de creixement, les cadenes serien més llargues. Encara que hi ha molts factors que influeixen en l'endarreriment de la separació de les cèl·lules. L'endarreriment en la separació de les cèl·lules un cop dividides pot ser una variable tan ambiental com genètica entre diferents soques, i d'altra banda no s'ha de pensar que l'organisme té una tendència infinita a formar cadenes. Així doncs, la relació entre longitud de les cadenes i el creixement de l'organisme s'ha d'estudiar més per obtenir un bon indicatiu que ens serviria al camp per estimar indirectament la taxa de creixement.
PROROCENTRUM MICANS/ P. TRIESTINUM/ P. LIMA
Prorocentrum micans (fig. 2.1.14 g) i P. triestinum són presents tot l'any a la costa catalana, particularment abundants durant els mesos càlids. La P. micans presenta densitats cel·lulars majors de 104 cèl·lules l-1 d'abril a agost i la P. triestinum arriba a densitats de 105-106 cèl·lules l-1 en mesos com abril i juny en els anys 1995 i 1996. P. lima és una dinoflagel·lada tòxica bentònica que sembla que és una de les fonts secundàries de la ciguatera (Yasumoto et al., 1980, Nakajima et al., 1981). En la nostra zona apareix esporàdicament al plàncton en baixes concentracions, encara que és important en abundància com a epífita de macroalgues, acompanyant altres espècies com Ostreopsis spp. i Colia monotis. La presència en el plàncton es dóna sobretot els mesos de juny, juliol, agost i setembre.
Els cicles de P. micans i P. triestinum es varen fer els dies 20 d'octubre de 1994 i el 8 de febrer de 1995 al port de Sant Carles de la Ràpita. La metodologia utilitzada està exposada en el capítol 2. Les condicions d'aquests cicles estan exposades en el capítol 3.1. Es varen mesurar les intensitats de fluorescència dels nuclis P. mican i de P.triestinum per conèixer les concentracions relatives de DNA (fase S, G2M). El cicle cel·lular en P. lima es va fer en cultius de laboratori. Els cultius varen créixer en un medi K a 16 i 19 ºC amb un cicle de llum i foscor de 16:8h amb una intensitat de llum de 150 µEm-2s-1 de fluorescent fred. Es varen mostrejar els cultius durant 24 hores en intervals de 2 hores. La fixació de les mostres i la tinció de DNA estan explicades en el capítol 3. Es varen mesurar les intensitats dels nuclis de P. lima per conèixer les concentracions relatives de DNA (fase S, G2M). Es van estimar les fases de doble nucli i les cèl·lules acabades de dividir de P. lima que poguessin servir d'indicador de la divisió, i també es van estimar les durades d'aquestes fases per aplicar el model de creixement per cicle cel·lular.
RESULTATS I DISCUSSIÓ
La forma nuclear de P. micans, P triestinum i P. lima fan que les mesures de intensitat de fluorescència siguin molt variables. S'ha de mesurar tota la intensitat que rep la cèl·lula en un pla horitzontal, descartant el fons. Si la forma del nucli és plana i bilobada, com és el cas de les espècies de Prorocentrum, les estimacions tenen una variabilitat important en la mesura de la intensitat i s'obté així histogrames de freqüencia com mostren les figures 2.1.5 i 2.1.6, amb uns coeficients de variació molt alts.
a. b.
Es varen obtenir coeficients de variació d'entre el 15 i el 30 % en les mesures de 200 a 300 cèl·lules per a cèl·lules en la fase G1 de Prorocentrum micans. La P. lima va presentrar coeficients de variació més grans, entre el 18 i el 35 %, en les mesures de 200 a 300 cèl·lules per a cèl·lules en la fase G1. Es varen obtenir coeficients de variació entre el 12 i el 27 % en les mesures de 200 a 300 cèl·lules en fase G1 de Prorocentrum triestinum.
Tant P. micans com P. triestinum i P. lima no són bones candidates per a mesures en microcitometria, encara que en citometria de flux la variabilitat dels histogrames de DNA pot disminuir per dues raons: pel número de comptatges que es fan en cada mostra, que és de dos ordres de magnitud i que les cèl·lules passen en les diferents posicions possibles. L'estudi futur del cicle cel·lular d'aquestes espècies ha de fer-se per citometria, amb la necessitat de posar a punt la metodologia de tinció i adquisició de les mostres, considerant que algunes espècies de Prorocentrum són de mida gran.
En relació a les mesures de cèl·lules binucleades i citocinesi en P. lima no es distingeix fases clares d'aquests estats cel·lulars (fig.2.1.7). Per una banda, el fet que la divisió nuclear i cel·lular pot donar-se en el mateix pla que la posició de la cèl·lula podria subestimar aquestes fases, pel fet que moltes vegades podrien passar per alt. Per altra banda són espècies de creixement molt lent i podria ser que algunes fases es perllonguessin en diversos cicles de llum i foscor (48, 72 hores) i que, per tant, en un cicle de 24 hores no es pogués copsar la freqüència d'aquestes fases.
a.
b.
GYMNODINIUM cf. PULCHELLUM
Gymnodinium cf. pulchellum és una espècie fototròfica amb diversos cloroplasts irregulars. El nucli és gran i localitzat a la part esquerra de la cèl·lula (Larsen, 1994).S'ha descrit que podria ser ictiotòxic (Onoue et al., 1985) i probablement és responsable de la mort de peixos en l'àrea de Melbourne (Larsen, 1994). Es va trobar en el port de la badia dels Alfacs el febrer de 1995.
MATERIALS I MÈTODES
El cicle es va fer el dia 22 de gener de 1995 al port de Sant Carles de la Ràpita. Les condicions d'aquest cicle estan exposades en el capítol 3.1. La metodologia utilitzada està exposada en el capítol 2. Es varen estudiar les fases del cicle cel·lular S (replicació del DNA) i G2 (espera abans de la divisió cel·lular) juntament amb la mitosi.
RESULTATS I DISCUSSIÓ
En el cicle realitzat el dia 22 de gener de 1995, la G. pulchellum presenta un màxim de la fase S en les primeres hores del període de foscor i una durada de 6.5 hores, la fase G2M té el màxim durant les 10 hores seguents en el període de foscor i una durada de 7.9 hores. La taxa de creixement in situ estimada és de 0.36 dia-1. El problema principal en aquest exemple no és l'aplicació del mètode sinó la identificació de l'espècie sobretot al microscopi òptic. Estem aplicant un mètode que és específic, i per tant el coneixement taxonòmic és important, entre altres coses per no barrejar organismes semblants morfològicament.
HETEROCAPSA NIEI
MATERIAL I MÈTODES
S'ha posat a punt en cultius de laboratori la metodologia per estimar les fases del cicle cel·lular de l'Heterocapsa niei (Cachonina niei) per citometria de flux. El protocol seguit està exposat en el capítol 2.
RESULTATS
Els gràfics, histogrames i l'estadística dels pics de cèl·lules en G1, S i G2M es mostren en la figura 2.1.9.
ALEXANDRIUM MINUTUM
L'Alexandrium minutum és considerada com la principal productora potencial de PSP a la costa catalana. Es presenta en aquesta part l'estimació de la taxa de creixement per cicle cel·lular d'A. minutum a partir de l'anàlisi de les fases cel·lulars de divisió. Alhora, es compara el sistema de microcitometria i citometria de flux per a la mesura del DNA i es compara la taxa de creixement bruta (per cicle cel·lular) i neta (per incubacions).
MATERIAL I MÈTODES
L'anàlisi de microcitometria d'A. minutum es va dur a terme en mostres naturals d'una proliferació massiva al port de Vilanova i la Geltrú. El dia 1 de febrer de 1996, després de la detecció el dia anterior de concentracions altes d'A. minutum, es van obtenir 10 litres d'aigua del port de Vilanova i la Geltrú. Es va fer un cicle de mostreig diari cada dues hores a temperatura ambient (de 12.5 a 15.5 ºC, 10:14h L:F) i un altra a la càmara de cultiu (19 ºC, 12:12h L:F). La fixació de les mostres i la tinció de DNA estan explicades en el capítol 2.
L'anàlisi de citòmetria de flux es va efectuar amb cultius d'A. minutum que varen créixer en un medi f/2-Si (Guillard, 1984) a 19 ºC amb un cicle de llum i foscor de 12:12h L:F a una intensitat de llum de 150 µEm-2s-1 d'un fluorescent fred. Es varen mostrejar els cultius durant 24 hores en intervals de 2 hores. La fixació de les mostres i la tinció de DNA estan explicades en el capítol 2. La concentració relativa de DNA va ser mesurada com a fluorescència vermella (< 650 nm) en el citòmetre de flux Scalibur Flow Cytometer al menys en 10.000 cèl·lules. Els histogrames de DNA varen ser analitzats com s'exposa en el capítol 2. L'estimació de la durada de les fases cel·lulars i la taxa de creixement per cicle cel·lular es va obtenir a partir de les fórmules 12 i 13. Es varen fer recomptes cel·lulars al principi i al final del cicle diari i la taxa de creixement es va estimar a partir de la fórmula 14.
RESULTATS I DISCUSSIÓ
L'A. minutum presenta les fraccions de les fases G1, S i G2M distingibles en el cicle de 24 hores fet amb mostres d'aigua del port de Vilanova i la Geltrú.
a.
b.
Per al cicle efectuat en A. minutum a 19 ºC, la fase S va tenir un màxim 7 hores després del començament del període de foscor i una durada de 5.2 hores. La fase G2M va tenir el màxim 4 hores després de l'alba i una durada de 7.7 hores. La taxa de creixement in situ estimada va ser de 0.25 dia-1. En les incubacions a temperatura ambient la fase S va tenir un màxim semblant a l'anterior cicle i una durada de 6.3 hores. La fase G2M va tenir el màxim semblant a l'anterior cicle i una durada de 6.8 hores. La taxa de creixement in situ estimada va ser de 0.24 dia-1. La taxa de creixement neta estimada a partir de recomptes cel·lulars en ambdues incubacions va ser de 0.20 dia-1. La taxa de creixement neta va ser menor. Ja que no s'ha observat diferències apreciables en els dos cicles fets a diferents temperatures i cicles de llum sembla que l'adaptació de les cèl·lules a aquests dos paràmetres pot trigar més d'un dia. Els valors de creixement obtinguts han estat considerablement molt baixos respecte d'altres mesures d'A. minutum fetes al port d'Arenys de Mar, en què les taxes eren superiors a 1 dia-1.
Cicle per citometria Els gràfics, histogrames i l'estadística dels pics de cèl·lules en G1, S i G2M es mostren en la figura 2.1.11.
El nombre màxim de cèl·lules en la fase S es va obtenir durant les 8 hores de foscor. El màxim de G2M es va observar al final del període de foscor, 12 hores després de no tenir llum. La durada de la fase S i la fase G2M s'estima entre 4.1 hores i 3.2 hores respectivament. La taxa de creixement in situ estimada amb les freqüències de les fases S i G2M del cicle cel·lular i la seva durada va ser de 0.42 dia-1. La taxa de creixement obtinguda per recomptes cel·lulars va ser de 0.31 dies-1.
Comparació del sistema de microcitometria i citometria de flux
La quantificació de DNA en poblacions naturals d'A. minutum s'ha de fer per microcitometria, en què les cèl·lules es distingeixen morfològicament per l'observador. La quantificació per citometria de flux necessitaria el marcatge immunoquímic específic de les cèl·lules per distingir-les de la resta de la població fitoplanctònica, el qual actualment no existeix. Així, l'anàlisi per citometria de flux queda restringida a poblacions de cultiu.
Taxa de creixement potencial (per cicle cel·lular) i neta (per comptatges cel·lulars)
La taxa de creixement net té en compte els factors de pèrdues com la mort cel·lular, per això sempre serà més petita que la taxa de creixement per cicle cel·lular. La diferència és una estimació de les pèrdues que pateix la població, molt important en l'estudi de les proliferacions d'algues. En el cas d'A. minutum, presentat aquí, la diferència entre el creixement net i el creixement per cicle cel·lular va ser de +0.11 dia-1. Diferències descrites entre creixement potencial i net poden anar de 0.01 a 0.21 dia-1 o de 3 a 40 % segons les condicions en què estiguin les cèl·lules (Antia et al., 1990). En els experiements de laboratori podem atribuir aquesta diferència a la mort cel·lular. En experiments al camp, les pèrdues s'amplien, a més de la mort cel·lular, a la sedimentació i la depredació, per exemple.
QUÈ ES CONEIX DEL CICLE CEL.LULAR DE LES DINOFLAGEL·LADES
Per concloure aquest capítol es presenta la informació sobre la durada de les fases del cicle cel·lular per a les diferents dinoflagel·lades estudiades en aquesta tesi, així com també dades de la bibliografia d'espècies que es coneix el seu cicle de divisió. Es fa referència a d'altres organismes eucariotes. El resum sobre el cicle cel·lular en el génere Dinophysis es presenta en el capítol 2.2, taula 2.2.2. En aquesta recopilació s'ha de tenir en compte l'article de Karentz (1983) on es troba la informació dels patrons de síntesi de DNA i divisió cel.lular en diverses dinoflagel·lades marines (Amphidinium carteri, Gonyaulax tamarensis, Gymnodinium nelsonii (G. splendens), Heterocapsa pygmaea, Prorocentrum triestinum, i Scrippsiella trochoidea). Malauradament la informació de la durada d'aquestes fases en les condicions concretes de cultius no es presenten en el treball. Es presenten a la vegada, fotografies amb la tinció el DAPI, mostrant el nucli de diferentes espècies de dinoflagel·lades, fig. 2.1.13, 2.1.14 i 2.1.15.
Taula 2.1.2. Durada de les fases del cicle cel·lular (en hores) de diverses espècies de dinoflagel·lades. µ és la taxa de creixement quan s'ha aplicat el model de cicle cel·lular expresat en dia -1, Td és el temps de duplicació o l'invers de la taxa de creixement expressat en dies per divisió, G1, S, G2, mitosi i citocinesi són les fases de divisió del cicle cel·lular eucariòta expresats en hores.
Figura 2.1.13. A, B i C, nuclis tenyits de Gymnodinium catenatum. Totes les escales són 10 µm.
Figura 2.1.14. A i B, nuclis tenyits de Ceratium furca. C, D, E, i F, nuclis tenyits de diverses dinoflagel·lades. G, nuclis tenyits de Prorocentrum micans. Totes les escales són 10 µm.
Figura 2.1.15. A i B, nuclis tenyits de Gyrodinium corsicum (capítol 3.1) C i D, nuclis tenyits de Gymnodinium sp. E i F, nuclis tenyits de Gymnodinium nelsonii. Totes les escales són 10 µm. |