DEFINICIÓ DE LA TAXA DE CREIXEMENT

La taxa de creixement d'una població µ és l'increment en nombre de cèl·lules N en el temps t:

(1)

Quan l'increment en nombre de cèl·lules en el temps és constant, la població és anomenada asincrònica (fig. 2.1a) i la seva taxa de creixement µ es pot expressar per la següent equació:

(2)

Quan totes les cèl·lules de la població es divideixen cada dia en un període de temps concret, la població és anomenada sincrònica. Quan només una porció de les cèl·lules es divideix cada dia, però ho fa en un interval de temps restringit, la població està en fase (Chisholm, 1981). En moltes espècies de fitoplàncton, el creixement és en fase (Coats i Heinbokel 1982, Waterbury 1986) concretament, moltes espècies de dinoflagel·lades (Hastings i Sweeney, 1964, Yamaguchi i Honjo, 1990, Reguera et al., 1995). L'expressió correcta del creixement respecte al temps és:

(3)

(4)

El temps de generació del fitoplàncton pot variar des de poques hores fins a pocs dies i és comú que duri al voltant de 24 hores (Furnas, 1990). En dinoflagel·lades pot variar des de 0.16-2.89 divisions per dia (taula 2.1).

Taula 2.1. Taxes de creixement de diferents espècies de dinoflagel·lades realitzades en el camp (in situ) i en cultius de laboratori de diversos autors. La taxa de creixement està expressada en divisions per dia o dia-1. Les tècniques utilitzades per a l'estimació de la taxa de creixement s'indiquen de la següent manera: N = increment en nombre de cèl·lules, DF = incubacions amb difusió, MI = índex mitòtic, CC = cicle cel·lular, T = incorporació timidina tritiada, C14 = incorporació carboni 14, DIAL = bosses de diàlisi.

MÈTODES PER A LA MESURA DE LA TAXA DE CREIXEMENT ESPECÍFICA(µ) DE FITOPLÀCTON EN EL CAMP

El mètode més directe per a la mesura de la taxa de creixemetn de la població de fitoplàncton consisteix en la incubació d'una mostra natural en un contenidor i estimar la taxa per l'increment en nombre cel·lular o la concentració d'un índex de biomassa (per ex.: clorofil·la) en funció del temps. Les mesures poden ser tedioses (comptatges de nombres cel·lulars) o amb manca de resolució taxonòmica (índex de biomassa). A més a més, la interpretació dels resultats es complica amb la interferència dels depredadors, perquè el que es mesura és la taxa neta, equivalent a la taxa de creixement grossa de la població menys les pèrdues degudes a la depredació. Es pot utilitzar un filtratge (Furnas, 1982) per eliminar els depredadors en les ampolles d'incubació, tot i que no és sempre efectiu quan la mida de les preses i els depredadors és semblant.

El fet de tancar una població natural dins d'un contenidor per un període de temps causa un seguit d'artefactes, com ara les interaccions de la xarxa microbiana o la contaminació per elements traça dels contenidors. El control i la quantificació d'aquests artefactes són difícils. Els efectes del tancament poden ser reduïts utilitzant incubadors amb permeabilitat que permetin la difusió dels nutrients des de l'ambient exterior (Owens et al., 1977), encara que no totes les cèl·lules creixen bé en aquestes condicions d'incubació, cosa que indica que els efectes del tancament no s'eliminen completament. Un altre exemple d'incubadors amb permeabilitat són les bosses de diàlisi utilitzades en bacterioplàncton i fitoplàncton (Tóth, 1980, Furnas, 1982, Furnas, 1990, Ferrier i Rassoulazadegan, 1991, Mura, 1997),que permeten la difusió de molècules més petites que proteïnes i s'equilibren amb l'aigua ambient en escales de temps de 4 hores.

En el passat aquesta estimació es seguia segons un model exponencial, que asumeix una divisió constant i una assimilació de carboni continu. McCormichk (1996) proposa tres models nous per estimar µ. El model de uptake division és el més complex i afegeix la informació específica del patró de divisió a tenir en compte i una aproximació directa per quantificar la dependència de µ al fotoperíode, donant més confidència en aplicar la taxa de creixement en estudis ecològics.

L'ús de marcadors del cicle cel·lular com a mesura de la taxa de creixement in situ s'ha realitzat en grups concrets com ara diatomees i dinoflagel·lades. Són tècniques d'equipament simple i consumeixen poc temps per marcar el segment del cicle cel·lular útil per estimar la taxa de creixement. Fins ara es coneixen en fitoplàncton tres homòlegs de proteïnes relacionades amb el cicle cel·lular, l'anomenada abans PCNA, proliferating cell nuclear antigen, la p24cdc2 (John et al., 1989, Rodriguez et al., 1993, Van Dolah et al., 1995)i la ciclina B (Lin i Carpenter, 1996).Aquests marcadors s’utilitzen per marcar en quin estat de divisó cel·lular es troben les cèl·lules i l'observador pot visualitzar la composició de la població de fitoplàncton i obtenir les cèl·lules que presenten el marcador. Utilitzant el model de cicle cel·lular es pot mesurar la taxa de creixement de les espècies (Lin, 1994, Lin, 1994, Lin i Carpenter, 1996).En el futur, i prenent l'avantatge que suposa el coneixement bioquímic del cicle cel·lular, les proteïnes relacionades i altres marcadors bioquímics cel·lulars es podran identificar amb tècniques d'immunofluorescència per utilitzar la metodologia del creixement per cicle cel·lular.

Encara que hi ha diferents mètodes per a la determinació de la taxa de creixement en dinoflagel·lades, la comparança dels mètodes encara no s'ha estudiat prou, fins i tot hi ha tècniques aplicables, com per exemple la citometria de flux, que no s'han desenvolupat i avaluat prou per dinoflagel·lades.

ÍNDEX MITÒTIC COM A ESTIMACIÓ DE LA TAXA DE CREIXEMENT

Per definició, la taxa de creixement és el procés pel qual les cèl·lules individuals o organismes incrementen la seva biomassa i/o els seus constituents químics. La divisió cel·lular és el procés on les cèl·lules es repliquen a elles mateixes. La variació temporal de la biomassa d'una població és el resultat del creixement cel·lular en biomassa i la divisió. Per tant, la divisió cel·lular en el temps ens donarà la taxa de creixement in situ, una taxa que considerarem potencial, perquè no es tenen en compte les possibles pèrdues de la població (com per exemple, la mort cel·lular).

Diversos autors reconeixen la utilitat d'obtenir l'estimació de la taxa de creixement de la població a partir de la porció de cèl·lules en un estat que coneixem i que en resulta la divisió cel·lular (Swift i Durbin, 1972, Carpenter i Chang, 1988). En aquesta tesi, la metodologia principal per estimar la taxa in situ de creixement específica ha estat a partir del coneixement del cicle cel·lular dels organismes i, per tant, a partir de la seva divisió cel·lular.

EL CICLE CEL·LULAR

El cicle cel·lular és una successió d'esdeveniments que separa el naixement d'una cèl·lula per divisió de la cèl·lula mare fins que aquesta cèl·lula es divideix per donar les seves pròpies filles. Per a ambdós, eucariotes i procariotes, el cicle cel·lular pot ser definit per dos esdeveniments: l'interval de la duplicació de DNA i el procés de la divisió cel·lular. En els eucariotes l'interval de la duplicació del DNA (fase S) és precedida i seguida per dos intervals de temps o gaps (G1 i G2 respectivament). La mitosi (M), és la partició del genoma duplicat i el material citoplasmàtic (fig. 2.2).

La regulació del cicle cel·lular en el fitoplàncton eucariòtic comparteix moltes característiques del model general de les cèl·lules eucariotes (Chisholm, 1981, Vaulot, 1985, Olson, 1986, Olson i Chisholm, 1986) quant a la síntesi de DNA precedida i seguida per dos intervals, G1 i G2. Els factors limitadors tenen diferents influències en la durada dels estats del cicle cel·lular: la limitació per temperatura indueix a un allargament en totes les fases, mentre que el nitrogen allarga només la fase G1 (Vaulot, 1987).Aquesta expansió sembla que és deguda a un punt de restricció localitzat en G1. La llum té una influència diferent en la durada del cicle cel·lular dels diferents grups de fitoplàncton: mentre que en cocolitoforals i dinoflagel·lades la limitació de la llum incrementa la durada de la fase G1 (Chisholm i Costello, 1980),en la diatomea Thalassiosira weissflogii tant la fase G1 com la fase G2 incrementen la seva durada en les mateixes condicions. Brzezinsky (1990 i 1992) suggereix que el punt de restricció que depèn de la llum en G2 és degut al component llum que depèn del sistema de transport del silici en aquesta diatomea. L'existència d'aquests punts de bloqueig poden ajudar a explicar els patrons de divisió de les diatomees, que es divideixen en tot el cicle de llum i foscor, i els cocolitoforals, que només es divideixen estrictament durant la nit.

Dins del grup de les dinoflagel·lades hi havia controvèrsies sobre la caracterització del seu cicle (eucariota o procariota) per les característiques concretes del seu nucli (per exemple, no tenen histones). No va ser fins l'any 1989 en que es va demostrar una fase S discreta (Homma i Hastings, 1989)indicant un tipus de cicle cel·lular eucariòtic per les dinoflagel·lades. Les últimes investigacions mostren com reguladors del cicle eucaròtic (per exemple les quinases dependents de ciclina) es troben en dinoflagel·lades (Van Dolah et al., 1995, Leighfield i VanDolah, 1998).

Les dinoflagel·lades tendeixen a presentar una regularitat específica en la replicació cel·lular, que s'ha anomenat divisió en fase (Hastings i Sweeney, 1964). En la divisió en fase, la citoquinesi ocórre en un moment específic durant cada cicle diari, encara que no totes les cèl·lules de la població es divideixin en cada període de divisió. Aquest patró resulta d'un ritme endogen on el període de divisió per a la població és de 24 hores.

MODEL D'OBTENCIÓ DE LA TAXA DE CREIXEMENT A PARTIR DEL CICLE CEL·LULAR

McDuff i Chisholm (1982) demostren que en qualsevol instant t les cèl·lules observades que estan en mitosi són aquelles cèl·lules que es dividiran en un temps posterior entre t i t+td, on td, és la durada de la mitosi. Si asumim que no hi ha pèrdua de cèl·lules i que la durada de la mitosi és la mateixa per a totes les cèl·lules de la població, el nombre de cèl·lules en mitosi (P) és igual a l'increment en nombre de cèl·lules des del temps de l'observació que s'ha fet fins que la durada de tots els estats de la mitosi acaben :

(5)

on t és el temps en que s'ha fet l'observació, N, el nombre de cèl·lules i td, la durada mitjana de la mitosi.

La fracció (f) de cèl·lules en mitosi en el temps (t) és igual a:

(6)

En poblacions en què la taxa de creixement està en fase amb un estímul periòdic (p. ex.: llum), el valor de µ està en relació a f i td. L'expressió matemàtica que dóna aquesta relació agafant logaritmes en l'equació (6) és:

(7)

L'equació ens diu que ln [1+f(t)] correspon a l'àrea de sota la corba de µ vs. temps en l'interval t a t+td (fig. 2.1).

En una població asincrònica, es considera que tant la taxa de creixement com la freqüència de cèl·lules en mitosi és constant, i així la taxa de creixement es calcula dividint per td:

(8)

En el cas de poblacions que es divideixen sincrònicament, com les poblacions fitoplanctòniques en fase al cicle de llum i foscor, µ no és constant i la mitjana dels valors de µ s'han de calcular des de la suma de les observacions seqüencials:

(9)

on és la taxa de creixement mitjana de la població per a un període de 24 hores durant el qual s'han tret n mostres.

La precisió de la mesura depèn de la diferència entre l'interval de mostreig i la durada de la mitosi (td); un mostreig més freqüent dóna uns resultats més acurats.

La durada de la mitosi és un paràmetre crític per la fórmula que es necessita per estimar la taxa de creixement. En el cas que poguem reconèixer la mitosi i els estats de divisió, la mesura de td pot ser calculada per l'interval de temps comprès entre una fase del cicle cel·lular i la següent.

Mcduff i Chisholm (1982), varen observar que si hi ha un període de temps en què totes les cèl·lules d'una població en fase es divideixen en un cicle de 24 hores i pot ser reconegut com a mitosi, la taxa de creixement pot ser calculada a partir del màxim valor de la fracció de cèl·lules en mitosi observada en un dia:

(10)

(11)

Carpenter i Chang (1988) proposen una modificació del mètode per la mesura in situ de la taxa de creixement de la població. El model es basa en la determinació, en intervals regulars durant el fotoperíode (llum i foscor) de la porció de cèl·lules en diferentes fases del cicle cel·lular (fig. 2.3).

El model utilitza la mateixa fórmula de McDuff i Chisholm (9), en la qual la mitosi es canvia per la suma de les fases de S i G2M del cicle cel·lular.

(12)

(12)

Si agafem un esdeveniment final llarg, com pot ser la mitosi, la precisió del mètode és més alta i requereix poques mostres per a cada cicle mesurat.

El mètode és un pas endavant per calcular la taxa de creixement de la població del fitoplàncton perquè no necessita una calibració externa per calcular la durada del temps de diferentes fases del cicle cel·lular. La fracció de cèl·lules en diferents fases del cicle cel·lular és directament mesurable amb els histogrames de les fases cel·lulars obtinguts per citometria de flux o microcitometria.

ASSUMPCIONS DEL MÈTODE

Tot el fitoplàncton es divideix en fase en el seu hàbitat natural. Si la divisió es dóna durant tot el dia, no hi ha pics clars de fraccions de cèl·lules en proliferació i és impossible estimar la durada de les fases .

Un cop la cèl·lula entra en fase dins del cicle, viatjarà a través d'ella d'una manera constant.

No hi ha pèrdues (mort cel·lular, depredació). En el cas de la depredació, es considera que no afecta el nombre de cèl·lules encara que l'augment en la mida cel·lular pot incrementar la seva probabilitat de ser interceptada pels consumidors. Així, es considera que els depredadors no mengen selectivament cèl·lules en un estat particular del cicle cel·lular i, per tant, la proporció de cèl·lules en una fase terminal encara reflecteix la taxa de creixement real (Chang i Dam, 1993).Fins i tot si és real que la depredació exerceix una veritable pressió sobre un estat específic del cicle cel·lular, el possible biaix que introdueix l'herbivorisme en el model descrit (Chang i Dam, 1993)el mètode segueix essent acceptable per a poblacions naturals.

Llavors, per aplicar aquest mètode és necessari determinar en les poblacions naturals les condicions següents:

La divisió ha d'estar en fase. En la natura sembla que es dóna la divisió en fase tant per a eucariotes com per a procariotes (Weiler i Eppley, 1979, Coats i Heinbokel, 1982, Waterbury, 1986)però la condició s'ha de provar des d'un principi.

Tot i les assumpcions i condicions, el mètode s'ha testat utilitzant una simulació i en poblacions naturals (Chang i Carpenter, 1985, Chang i Carpenter, 1988, Chang i Carpenter, 1991, Chang i Carpenter, 1994).El model simulat i les dades reals de camp ens demostren que és encara tolerant en situacions que no segueixen les condicions originals. L'error calculat en les estimacions de la taxa de creixement de la població en casos concrets queda en un 22 % (Chang i Carpenter, 1990).

TÈCNIQUES

La microcitometria ha estat la metodologia principal, mesurant els continguts relatius d'àcids nucleics de les cèl·lules i obtenint així les fases G1, S, G2 i M del cicle cel·lular per valorar el nombre de cèl·lules que es dividien. Altres fases cel·lulars s'han seguit mitjançant marcadors morfològics de la divisió cel.lular, per exemple, les cèl·lules acabades de dividir.

Citometria de flux i microcitometria

Les dues tècniques són diferents camins per mesurar la intensitat de fluorescència dels complexos DNA-fluorocroms per a cada cèl·lula. Les dues categories més comunes en les tincions de DNA són el Iodur de Propidi (excitat en la banda blava) i el DAPI, Hoechst-22242, Hoechst-22258 (excitats en la banda dels UV). El Iodur de Propidi és una tinció intercalant que s'uneix al DNA i a la doble cadena de RNA (llavors s'ha d'utilitzar amb conjunció a RNasa per digerir el RNA), mentre que el DAPI i el Hoechst s'uneixen amb el bucle petit de l'hèlix de DNA i no tenyeixen el RNA. El Hoechst-2242 és l'únic que tenyeix satisfactòriament cèl·lules vives. Les altres tincions requereixen d'una permeabilització de la membrana cel·lular abans de la tinció, que sovint es fa amb detergent, un tractament hipotònic i, en el nostre cas, amb una fixació amb un solvent (per exemple, el metanol). Val a dir que la fixació amb dissolvents produeix, a vegades, una considerable agregació de cèl·lules.

MICROCITOMETRIA

La tècnica de la microcitometria consisteix bàsicament a mesurar l’intensitat de fluorescència de les partícules microscòpiques marcades amb un colorant quan incideix sobre elles una determinada longitud d'ona. La base conceptual dels mètodes microcitomètrics és la mateixa que la de la tècnica de citometria de flux, de fet, aquesta darrera només suposa una estratègia diferent pel que fa referència a la presa de mesures, ja que, en definitiva, es fonamenta en la primera. Ambdós mètodes permeten obtenir informació i analitzar quantitativament substàncies intracel·lulars. L'anàlisi de paràmetres vindrà determinat pel tipus de tinció, així com la sensibilitat dels aparells. De fet, les tincions utilitzades en la tècnica de citometria de flux són emprades per l'anàlisi de mètodes microcitomètrics i els resultats obtinguts són equiparables.

MATERIALS I MÈTODES

Es presenta el sistema de microcitometria (microscopi d’epifluorescència amb el sistema fotomètric) en la figura 2.5.

Es descriu amb detall la metodologia, encara que els procediments estan descrits en Chang i Carpeneter (1988) per al cas de la microcitometria i per Vaulot (1987, 1989) per a la citometria de flux perquè s'han introduit petites modificacions indicades amb el símbol *.

PROTOCOL EXPERIMENTAL

1. Es recullen mostres d'aigua cada dues hores durant cicles de 24 hores amb una xarxa o filtre de 10 µm de malla per concentrar les cèl·lules (*).

2. Un volum de 100-200 ml d'aquestes mostres es filtra per una malla de 60 µm per extreure els organismes més grans (*).

2. Es recull el filtrat amb metanol fred i s’emmagatzema en fred (-20 ºC) un mínim de 8 hores per a l’extracció de pigments.

MESURA DEL CONTINGUT NUCLEAR CEL·LULAR PER MICROCITOMETRIA

4. Una submostra en metanol se centrifuga a 10.000 rpm durant dos minuts.

5. TINCIÓ AMB DAPI

El DAPI és un colorant citològic fluorescent que tenyeix el DNA (Falkowski i Owens, 1982)

Material:

solució tampó fosfat salí (PBS) 0.01 M (*)

0.0027 M clorur de potassi

0.127 M clorur de sodi

ph 7.4 a 25ºC. Guardar la solució estoc a 2-8 ºC. Descartar si hi ha torbidesa

Dapi (Sigma Cat. N. P 4170) stoc 0.1 mg/ml (bo per a un any)

El pellet és rentat i centrifugat en solució tampó PBS dues vegades. Finalment és resuspès amb la mateixa solució tampó i tenyit amb DAPI (4,6-diamino-2-fenilindol) en una concentració final de 0.5-1 µgr/ml (depèn de la concentració final de les cèl·lules) un mínim d'una hora..

6. La mostra de cèl·lules tenyides es centrifuga a 10.000 rpm dos minuts per obtenir un volum mínim i es col·loca entre portaobjectes i cobreobjectes.

Les observacions i recomptes per estimar les freqüències de les fases cel·lulars es realizen amb un microscopi Nikon Optiphot d'epifluorescència amb un sistema de microcitometria (Nikon P1) que permet mesurar la intensitat de fluorescència en una àrea determinada. El microscopi s'estabilitza durant mitja hora abans de prendre les mesures. Un mateix control es passa al principi i al final de les mesures. Es calibra el microcitòmetre a un valor de 0 cada cop que es pasen mostres.

7. Entre 250 i 200 cèl·lules són mesurades a cada mostra per construir l'histograma de DNA (fig. 2.2).

8. El pas de llum del fotomultiplicador es restringeix per una finestra suficientment gran per admetre la llum de tot el nucli de la cèl·lula mesurada i evitar al màxim el fons. En el cas especial de l'orientació del nucli en forma d'U (font important de variació en les mesures del DNA en algunes espècies de dinoflagel.lades) es va tenir la cura de mesurar els nuclis sempre en la mateixa posició ventral en què es reconeix la forma de U.

9. Consideracions a l'hora de fer les mesures:

9.1. La mida de la finestra influeix en la mesura de la intensitat mesurada. S'ha d'escollir una mida de finestra.

9.2. Ajustar la intensitat (voltatge que se li dóna a la llum) segons si les cèl·lules estan més o menys tenyides (igual en citometria). Les sensibilitats i el voltatge poden variar entre mostres diferents, i per tant, s'han d'establir per a cada sèrie de mesures. Normalment no varien en mostres tenyides el mateix dia amb concentracions cel·lulars i de tinció semblants.

9.2. Es pot donar descoloriment (fading) si el temps en que s'està fent la mesura és llarg. Proves realitzades indicaven que no es donava descoloriment en les nostres mostres almenys en un minut, quan per a la presa de mostres es triga 2 segons.

9.4. Es fa una mesura en el fons per tenir un blanc que es tindrà en compte en totes les mesures.

9.5. Controls interns: eritròcits de pollastre, boletes de calibració i cèl·lules en un estat de G1 i un contingut de DNA conegut. Els controls es barregen amb la mostra a tenyir per seguir el mateix protocol.

9.6. Controls externs: es passa la mateixa mostra abans i després de la presa de mesures.

OBTENCIÓ DELS HISTOGRAMES DE FREQÜÈNCIA

10. Els valors obtinguts de quantitat de DNA per nucli són agrupats en classes i després representats en histogrames de freqüències. En l'eix d'ordenades es representa el nombre de cèl·lules mesurades i en l'eix de les abscisses, la quantitat de DNA en unitats arbitràries.

11. Per comparar els histogrames a diferents hores es normalitzen les dades pel canal del pic de la fase G1 o pel control intern de les mostres.

ANÀLISI DEL CICLE CEL·LULAR. CONTINGUTS DE DNA DIPLOIDES

Sigui quina sigui la tinció que es faci servir, s'ha de veure en la població cel·lular un patró característic del cicle cel·lular. En les cèl·lules que estan en G1, el contingut de DNA presenta una distribució d'intensitat de fluorescència estreta. Com que totes les cèl·lules en G1 tenen el mateix contingut de DNA, s'ha de detectar en teoria la mateixa fluorescència per a cada cèl·lula i nomes s'ha de veure un canal únic (fig. 2.6).

Això passa si, el microcitòmetre i el citòmetre de flux estan perfectament calibrats i si la tinció de DNA és perfectament uniforme. Però, a la pràctica, hi ha una varietat d'error instrumental, a més de la variabilitat biològica en la tinció de DNA. Llavors, la fluorescència mesurada de les cèl·lules en G1 és normalment una distribució gaussiana. La distribució en forma de campana és característica de la variació en cada mesura.

El terme coeficient de variació (CV) s'utilitza com a descriptor de l'amplada del pic.

(14)

El CV és una mesura en relació a la desviació estàndard de la distribució (normalment un pic gaussià), però normalitzat per fer-lo independent del canal de la mitjana de la distribució. Per a distribucions normals o gaussianes, la desviació estàndard és 0.426 vegades l'amplada del pic a la meitat de la seva alçada màxima.

Igualment, les cèl·lules en fase G2 i mitòtiques, que tenen el doble contingut del DNA de G1, produeixen una corba gaussiana en l'histograma de contingut de DNA amb la posició mitjana doble que el pic de G1. La relació G2/G1 normalment és menor que 2, ja que el paquet proteïna-DNA (cromatina) a vegades està més condensat o a vegades és més laxa. Llavors, la tinció del DNA normalment té una accessibilitat diferent en els llocs d'unió. Una raó de G2/G1 de 1.97 és més comuna. La fase S en teoria s'observa en l'histograma començant tot just des de la posició ocupada per les cèl·lules en G1 fins a la posició de les cèl·lules en G2. Totes les cèl·lules comencen a sintetitzar DNA en la fase S i han d'incrementar el contingut fins a la fase G2.

Però els histogrames no són tan senzills, perquè una part de les distribucions de G1 i G2 poden estar ocupadees per la distribució de S (superposcició o overlapping). Tenint en compte la superposcició, s'han de corregir les proporcions de les fases cel·lulars G1, S i G2.

En el programa Multicycle s'ha utilitzat el mètode que es basa a reconèixer l'histograma del cicle cel·lular com el resultat d'una distribució gaussiana en G1 i G2 (Dean i Jett, 1974). La fase S s'ajusta a una distribució gaussiana eixamplada. Aquesta distribució s'ajusta a una corba polinomial de segon ordre de forma corbada. El mètode utilitzat per ajustar el pics gaussians i superposició de la corba S es fa pel procediment descrit en Marquardt (1962) com un ajustament no lineal de mínims quadrats. El mètode d'ajustament produeix unes matrius matemàtiques complexes i iteraccions successives fins que l'ajustament de la corba és el correcte. Té l'avantatge que el resultat final és relativament independent de les estimacions inicials i això ajuda a treure la variabilitat de l'operador dels resultats del Multicycle.

Casos especials en què el programa ha de generar uns models diferents són: (1) fases S sincròniques descrites per a algunes espècies de dinoflagel·lades (Karentz, 1983). El programa pot generar el model en què es por afegir un pic adicional que correspondria a la fase S. (2) Dos cicles superposats, per ex., cèl·lules en diferents estats del cicle biològic, cists i cèl·lules vegetatives. (3) Soroll de fons. (4) Agregació nuclear: els doblets en G1 es poden superposar amb el pic de G2 (la fixació amb un solvent i la centrifugació provoca fàcilment agregats).

MODEL DE LA TAXA DE CREIXEMENT PER CICLE CEL·LULAR

Per determinar la taxa de creixement in situ a partir de les fases del cicle cel·lular es va seguir el model exposat per Carpenter i Chang (1988). La taxa de creixement a partir de l'anàlisi de cicle cel·lular s'estima utilitzant les fases S, G2 i M com a moment final de la divisió cel·lular per a la fórmula (12) i la durada del moment final s'estima a partir de la fórmula (12).

Els percentatges de les fraccions de les cèl·lules en cada estat es representen en el temps.

Per estimar les màximes freqüències de cada fase cel·lular mesurada i, per tant, la durada de les fases es varen ajustar les dades a una corba polinomial de quart ordre tenint en compte tots els punts. El màxim de les corbes polinomials s'utilitza per obtenir la durada de les fases escollides.

PROBLEMES DE LA TÈCNICA

1. Els coeficients de variació depenen del nombre de cèl·lules mesurades, de la forma dels nuclis de les dinoflagel·lades i del grau de condensació de la cromatina dels nuclis (i per tant de la tinció).

2. Les espècies en què la morfologia del nucli dificulta la mesura de fluorescència, la metodologia més adequada seria el citòmetre de flux.

2. Els pics de freqüències de cada estadi moltes vegades no es veuen clars per diverses causes. Per una banda l'error que fem en mostrejar i en comptar: el mostreig s'ha d'adequar en un període de temps concret i tan sovint com calgui per veure bé el pic de cada estadi, el número de comtatges pot ser insuficient. Per altra banda, una divisió nuclear i cel·lular molt ràpida fa que no puguem veure un patró amb la claretat desitjable.

4. Si no es distingeixen els estats del cicle biològic com cèl·lules vegetatives, gamets i cists, i queden barrejats, es pot emmascarar el model de cicle cel·lular, pel fet que és normal tenir diferents continguts de DNA en aquests estats cel·lulars.

MICROCITOMETRIA I CITOMETRIA DE FLUX

Un avantatge de la microcitometria sobre el citòmetre de flux és que cada cèl·lula pot ser vista i identificada sota el microscopi de fluorescència. Llavors, en una mostra de camp amb moltes espècies de fitoplàncton, som capaços d'obtenir l'histograma de DNA per a cada espècie. També, la microcitometria és més convenient per mesurar el contingut de DNA de cada cèl·lula per a espècies formadores de cadenes. No hi ha el problema de distingir doblets ni agregats de cèl·lules i podem reduir molt el soroll de fons des d'un principi.

Els trets més significatius del citòmetre de flux respecte a la microcitometria són la rapidesa d'anàlisi, la sensibilitat de les mesures i l'exposició dels fluorocroms a l'excitació de la llum per un curt i constant període de temps, que permet obtenir mesures més acurades. Amb l'anàlisi multiparamètrica podem mesurar a més del contingut de DNA, proteïnes, clorofil·la i altres paràmetres de cada cèl·lula a la vegada.

La limitació que presenta la tècnica de la citometria de flux és la manca de marcadors que permetin distingir una població cel·lular concreta dins de tota la comunitat que s'analitza, si no és que s'estudiï una població molt concreta de cèl·lules, com per exemple, els cultius monoespecífics. El desenvolupament de marcadors específics en dinoflagel·lades i concretament en espècies que formen marees roges ha estat una línia de recerca important dins del camp de les proliferacions tòxiques (Vrieling et al., 1994)

La lentitud amb què s'obtenen les mesures en microcitometria és la major limitació quan es precisa analitzar poblacions relativament grans de cèl·lules.

MESURA DEL CONTINGUT NUCLEAR CEL·LULAR PER CITOMETRIA DE FLUX PER A L' ALEXANDRIUM MINUTUM.

PROTOCOL TINCIÓ AMB IODUR DE PROPIDI PER A CITOMETRIA DE FLUX

MATERIALS

solució tampó fosfat salí (PBS) 0.01 M (*)

0.0027 M clorur de potasi

0.127 M clorur de sodi

ph 7.4 a 25 ºC. Cal guardar la solució a 2-8 ºC. Cal descartar si hi ha turbidesa.

Tincio Iodur de propidi

Iodur de propidi (Sigma Cat. N. P 4170) estoc 0.1 mg/ml (bo per un any)

RNasa (USB RibonucleasaA bovine pancreas, Cat no. 21210) estoc 105 unitats/ml

Concentració final de la tinció per 1 ml de mostra (*)

40 µl PI (0.1 mg/ml esotc) ------------------ 4 µg/ml PI

11 µl RNasa (105 unitats/ml estoc) ------ 1250 unitats RNAsa

949 µl PBS

MÈTODE

1. Es fixen les cèl·lules amb un 5% de formol durant 10 minuts. Cal utilitzar material fresc. (*)

2. Es centrifuga 2500 rprm durant 4 minuts

2. S'aspira el sobrenedant

4. S'afegeixen 10 ml metanol fred(-20 ºC) al pellet

5. S'emmagatzema a 4 ºC fins la tinció, al menys un dia

6. Es passa 1 ml de la mostra a un eppendorf. Almenys calen 500 cèl·lules per fer una bona anàlisi.

7. Es centrifuga a 10 000 rpm durant 2 minuts.

8. S'aspira el sobrenedant

9. S'hi afegeix 1 ml de PBS

10. Es centrifuga 10 000 rpm durant 2 minuts

11. S'aspira el sobrenedant

12. S'hi afegeix 40 µl PI (0.1 mg/ml esotc), 11 µl RNasa (105 unitats/ml estoc), 949 µl PBS

12. Es deixa la tinció de les cèl·lules a temperatura ambient almenys durant 1 hora en la foscor.(*)

14. Es passen les mostres pel citòmetre, de 4 a 6 minuts a baixa velocitat.

No s'han de rentar les cèl·lules després de la tinció. Si hi ha precipitats en els primers passos, s'han de rentar almenys dues vegades amb el PBS.

Les modificacions segons el protocol publicat per a dinoflagel·lades estan marcats amb el símbol (*). La concentració final de tinció depèn del nombre de cèl·lules i s'ha de buscar una concentració mínima que permeti obtenir bons histogrames sense un excés de tinció, i per tant de fons. El punt 1 és opcional segons les espècies de dinoflagel·lades a tenyir. Per exemple els organismes sense teca queden mal fixats directament al metanol, però a la vegada pot ser contraproduent deixar molt de temps les mostres amb formol perquè després dificulta l'entrada del colorant. Per a una bona permeabilització moltes vegades s'utilitza un detergent (per exemple, tritó) per facilitar l'entrada del colorant, atès que es treballa amb cèl·lules senceres que moltes vegades tenen cobertes cel·lulars força resistents. El punt 12, es refereix al fet que que el temps de la tinció es pot accelerar amb una incubació al bany a 27ºC per augmentar l'acció de la RNasa. Finalment, s'ha de dir que s'ha de buscar la millor combinació de fixació, permeabilització i tinció per a cada espècie.

EXEMPLES DE L'APLICACIÓ DEL MODEL DE CREIXEMENT PER CICLE CEL·LULAR

Exemples de l'apliació del model exposat de creixement són desenvolupats en els capítols següents, en relació a les taxes de creixement in situ, el capítol 2.2 on es presenta el cicle cel·lular i creixement per a la Dinophysis sacculus i el capítol 2.3 i 3.1 on es presenta el cicle cel·lular i creixement per a la Ceratium furca, així com la informació obtinguda en aquest sentit en altres espècies de dinoflagel·lades, capítol 2.1.

METODOLOGIA PARAL·LELA PER A LA TAXA DE CREIXEMENT. CAIXES D'INCUBACIÓ IN SITU

El mètode més directe per determinar la taxa de creixement in situ del fitoplàncton és tancar la població en un contenidor, incubar-ho allà mateix i calcular la taxa de creixement (o mortalitat) mitjançant l'increment (o decrement) en nombre cel·lular (Furnas, 1982), biovolum (Sheldon, 1979), o la concentració d'un índex de biomassa (Falkowski i Owens, 1982). Per tal de minimitzar els efectes de tancament de les incubacions es varen utilitzar unes caixes permeables. Per a una revisió d'aquesta metodologia vegeu Sakshaug i Jensen (1978). La tècnica no elimina els efectes mecànics de la paret, ni la depredació en tota la seva totalitat, però hi ha un contacte fisicoquímic i biològic entre la població tancada i l'ambient de fora, cosa que permet que continuï el creixement als nivells de nutrients externs durant un període de temps raonable (Furnas, 1982).

Definim la taxa de creixement per incubacions com una taxa neta, en front a la taxa estimada per cicle cel·lular que també anomenem potencial.

MATERIAL I MÈTODES

Les cambres varen ser incubades a diferents punts in situ i es col·locaren a diferents profunditats. Es va decidir fer incubacions de tres dies per permetre canvis significatius en el nombre de cèl·lules sense que un període massa llarg incrementés el fet de tancament de les incubacions.

Per a les avaluacions de la taxa de creixement en períodes de dies es varen fer recomptes al principi i al final de cada incubació. Es varen fer recomptes acurats, ja que la taxa de creixement depèn molt d'aquesta dada.

La taxa de creixement fou calculada a partir dels canvis en nombre cel·lular per l'equació:

(14)

on i son les concentracions cel·lulars en els temps i respectivament (Guillard, 1973)

Evitació de la depredació

Per tal de determinar l'efecte de la depredació del zooplàncton es varen incubar caixes de difusió amb la població natural filtrada per un filtre de 60 µm (per reduir al màxim els possibles depredadors) i es varen comparar amb les incubacions d'aigua no filtrada. No es poden evitar, però els depredadors més petits que el filtratge i que per mides es superposen a la mida de la població que s'avalua no es poden treure. A causa del creixement de bacteris i cèl·lules a la superfície, la membrana canvia les seves propietats durant experiments llargs, cosa que pot reduir el flux de nutrients a través de la membrana. Cal doncs, netejar les membranes per a les noves incubacions o canviar les caixes sovint.

El procediment general per al recompte de mostres va ser:

1. Fixació de les mostres amb formol (1% concentració final)

2. Sedimentació de les mostres en cambres de 50 ml

2. Recompte dels organismes presents en àrees apropiades mitjançant un microscopi invertit d'epifluorescència.

EXEMPLES DE L'APLICACIÓ DEL MODEL DE CREIXEMENT NET PER CAIXES D'INCUBACIÓ

En el capítol 2.4 es desenvolupa un exemple de l'apliació del model exposat de creixement net on es presenta el creixement per a l'Alexandrium minutum en caixes d'incubació en una situació de proliferació massiva d'aquest organisme. S'han utilitzat les incubacions permeables al llarg de tots els treballs presentats com a comparació de la taxa de creixement obtinguda per cicle cel·lular.