INTRODUCCIÓ

Molts factors físics, químics i biològics en bona combinació donen lloc al desenvolupament i persistència d'aquestes proliferacions algals. Estudis d'aquests factors biològics i sobretot de les estratègies dels cicles de vida de les dinoflagel·lades ajuden a explicar la dinàmica poblacional dels organismes, la iniciació o fi de la proliferació, la supervivència en llargs períodes i la recurrència de les proliferacions. L'estratègia reproductiva i l'encistament de cèl·lules vegetatives quan les condicions ambientals no són favorables estan descrites per diverses espècies de dinoflagel·lades (Anderson i Wall, 1978, Tyler et al., 1982). A vegades, les cèl·lules passen un temps com a cists bèntics dormits i s'excisten quan les condicions tornen a ser favorables. Els cists de resistència són formes d'hivernació de llarga durada. S'ha descrit, també, per a algunes dinoflagel·lades, la formació de cèl·lules bèntiques anomenades cists temporals (Anderson i Wall, 1978, Kita et al., 1985, Doucette et al., 1989, Fritz et al., 1989, Kita et al., 1993, Montresor, 1995), els quals no tenen un període de dormició tan llarg com els cists de resistència i poden germinar en períodes curts de temps.

La dinoflagel·lada A. taylori produeix proliferacions recurrents en platges relativament obertes de la costa catalana i illes Balears durant el període més càlid de l'any (juliol-agost). S'han descrit proliferacions recurrents des de 1994 a la Fosca (Costa Brava). Estudis previs sobre la morfologia d’A. taylori (Delgado et al., 1995, Delgado et al., 1997) suggerien que les formes de vida de l'organisme, els estats mòbils (cèl·lules vegetatives) i no mòbils (cists temporals i de resistència) podien ser rellevants per l'estratègia de formació i manteniment d'altes densitats cel·lulars. En aquest treball s'utilitzarà el concepte de cist de resistència com un zigot en dormició i el concepte de cist temporal com un estat de restricció temporal amb el mateix sentit que s'explica en Taylor (1987).

L'objectiu d'aquest capítol és descriure els estats del cicle de vida d'A. taylori, el cicle de divisió de les cèl·lules vegetatives i els cists temporals. Quan s'estudia els cicles de vida, és important investigar l'alternança de les fases nuclears. La diferenciació entre les cèl·lules haploides i diploides es pot realitzar amb el desenvolupament de la microfluorometria com a tècnica de desenvolupament de la determinació del contingut nuclear de DNA (Carpenter i Chang, 1988, Cetta i Anderson, 1990, Yamaguchi, 1992). En aquest capítol utilitzem la microfluorometria per a quantificar el contingut nuclear de les cèl·lules vegetatives i els cists temporals de l'A. taylori. La tècnica també s'ha utilitzat per descriure el cicle cel·lular de la dinoflagel·lada analitzant el patró diari de síntesi de DNA. La taxa de creixement in situ de les cèl·lules vegetatives s’estima pel mètode de l'anàlisi de cicle cel·lular. La fase de mitosi dels cists temporals s'ha utilitzat per estimar la taxa de creixement in situ.

MATERIAL I MÈTODES

Àrea d'estudi

La Fosca és una cala de la Costa Brava situada a 41º 50’ N, 3º 9’ E, a uns 2 km al nord de Palamós. Té una forma aproximadament rectangular, de dimensions de 525*300 m, amb l'obertura orientada cap al SE. Les seves profunditats mitjanes i màximes són de 3 i 7 m, respectivament, i amb pendent suau, força uniforme entre 2 i 7 m. La mida de sediment varia entre 0.467 mm a 0.286 mm amb un 98 % de sorra amb diferents punts al llarg de la platja caracteritzats per materials fins. La platja es troba dividida en dues àrees separades per la roca Negra que s'endinsa uns 30 metres en el mar i divideix la cala de la Fosca i St. Esteve. Al nord es troben cala S’Alguer i la platja de Castell, en aquesta última descarrega un torrent principalment durant la primavera i la tardor, a l’estiu, el torrent se seca i no hi ha indicis d’influència continental en tota la zona la Fosca, S’Alguer i Castells. Tota la zona és molt turística, amb una freqüentació molt elevada durant els mesos de juliol i agost.

A causa dels diferents aspectes per estudiar, es varen seguir diferents mostrejos i diverses metodologies des de les diferents tècniques de microscòpia òptica, epifluorescent i de transmissió per a l'observació de les morfologies de les cèl·lules fins a les diferents tincions específiques per a la quantificació dels àcids nucleics i per a l'observació de les parets cel·lulars.

Condicions de cultiu

Morfologia

La morfologia de les cèl·lules es va observar en mostres de camp i en els cultius de laboratori. Per a l'observació de la morfologia i quantificació de cèl·lules vegetatives i cists temporals es varen fixar mostres d'aigua en formol 1 % i sedimentades en cambres de 50 ml. Per distingir les cèl·lules vegetatives i els cists temporals es varen tenyir les mostres amb calcofluor, un colorant específic per a les parets de cel·lulosa (Fritz i Triemer, 1985). Els tipus cel·lulars varen ser quantificats al microscopi d'epifluorescència invertit observant les cèl·lules que presentaven una teca ben definida amb la tinció del calcofluor que correspon a les cèl·lules vegetatives i les que no queden tenyides que corresponen als cists temporals.

Les mostres de cultiu per al microscopi electrònic de transmissió varen ser fixades en una barreja de glutaraldeid i paraformaldeid (1 %) i 0.1 M solució tampó cacodilat (pH = 7.2) i encapsades en bombolles d'agar segons el mètode de Hernández (1992). Es va postfixar en OsO4 a l'1 % en la mateixa solució tampó. Després de rentar amb aigua destil·lada, es varen deshidratar les mostres en una sèrie d'alcohols i es varen incloure en el medi Spurr resin (AG, Fluka). Es varen tallar seccions molt primes, es varen tenyir amb acetat d'uranil, i van ser observades en un Philips 200 Transmission Electron Microscope.

Gamets i planozigots

Cist de resistència.

Canvis diaris en les cèl·lules vegetatives i cists temporals

Taxes de creixement in situ. Microfluorometria

Per estimar la taxa de creixement in situ de les cèl·lules vegetatives i la taxa de divisió dels cists temporals al camp es va seguir la microfluorometria com a metodologia principal, mesurant els continguts relatius d'àcids nucleics de les cèl·lules i així es van obtenir les fases G1, S, G2 i M del cicle cel·lular, (veure capítol 3). Per l'estima quantitativa dels continguts d'àcids nucleics de les cèl·lules vegetatives, es varen fer anàlisis bioquímiques.

Alhora es varen estimar taxes de creixement netes de l'organisme en cultius de laboratori en condicions constants per comparar amb la taxa in situ estimada a partir del cicle cel·lular, (capítol 2).

Es varen recollir mostres d'aigua cada dues hores a la platja de la Fosca el 2-3 d'agost de 1995, i el 19-20 d'agost de 1996, en superfície durant cicles de 24 hores amb una xarxa de10 µm de malla per concentrar les cèl·lules. Un volum de 200 ml d'aquestes mostres es filtrava per una malla de 60 µm per extreure els organismes més grans d'aquesta mida. La mesura del contingut nuclear cel·lular de les cèl·lules vegetatives segueix el protocol exposat al capítol 2. Com que l'orientació del nucli en forma d'U de l’A. taylori pot ser una font important de variació en les mesures del DNA es va tenir la cura de mesurar els nuclis sempre en la mateixa posició ventral en què es reconeix la forma d'U.

Per a determinar la taxa de creixement in situ a partir de les fases del cicle cel·lular es va seguir el model exposat al capítol 2. La taxa de creixement a partir de l'anàlisi de cicle cel·lular va ser estimada utilitzant les fases S, G2 i M com a esdeveniment final de la divisió cel·lular per a la fórmula 11 i la durada de l'esdeveniment final s'estima a partir de la fórmula 12.

Com que les observacions morfològiques in situ ens indicaven que els cists temporals es podien dividir, es va estimar la taxa de divisió mínima in situ dels cists temporals sobre la base de l'índex mitòtic modificat per Vaulot (1992), (capítol 2, fórmula 11). La fase escollida en els cists temporals va ser la mitosi. El concepte de taxa de divisió mínima in situ en aquest treball s'utilitzarà com a taxa de divisió cel·lular només en els cists temporals.

RESULTATS

Morfologia de les cèl·lules vegetatives, els cists temporals i els cists de resistència; divisió de les cèl·lules vegetatives i els cists temporals.

Les cèl·lules vegetatives d'A. taylori en el camp fan entre 26 i 43 µm de llargada (mitjana de 34 µm) encara que en cultiu la variabilitat incrementa significativament amb organismes de 70 µm de llargada. El patró de plaques està descrit en un treball a part sobre la variabiliatat morfològica dins de la citada espècie (Delgado et al., 1997).

Les cèl·lules vegetatives presenten diversos cloroplasts en el citoplasma i el nucli en forma d'U (fig. 3.2.1). Les cèl·lules vegetatives són de color verd fosc i presenten reserves de midó i lípids. Els grànuls de midó estan dins dels cloroplasts que tenen un sistema lamelar disminuït, es troben dispersos pel citoplasma i varien en mida i forma. Els lípids es troben en forma de gotes de mida variable. Els organsimes presenten una teca que es pot trobar separada de les cèl·lules vegetatives en les mostres fixades.

Les cèl·lules vegetatives presenten el procés d’ècdisi que es refereix a la pèrdua completa de la teca. El procés d’ècdisi necessita que totes les membranes de l'amfiesma externes a les plaques de la teca mudin, incloent-hi el flagel, que té la membrana en continu amb la membrana cel·lular (Morrill i Loeblich III, 1981). Llavors es troben moltes teques buides en els cultius i en les mostres fixades. La capa interior que envolta les cèl·lules és el pellicle que es troba en diverses dinoflagel·lades (Höhfeld i Melkonian, 1992).

La divisió vegetativa o citocinesi d'A. taylori es produeix en la cèl·lula mare i dona dues cèl·lules filles que continuen enganxades per un temps i conserven part de la paret de la cèl·lula mare (fig. 3.2.2). Les cèl·lules filles estan envoltades per el pellicle durant la divisió i la regeneració de la part de la teca que manca de la cèl·lula mare.

Les cèl·lules vegetatives produeixen els cists temporals molt ràpidament (en hores) per ècdisi. La capa que envolta les cèl·lues resultants és el pellicle, i llavors aquestes formes temporals poden ser anomenades cists d'ècdisi o pellicle cyst. Alhora aquests cists donen cèl·lules mòbils en qüestió d'un dia. El procés d'encistament temporal de les cèl·lules vegetatives es dóna en cèl·lules actives fotosintèticament que arriben a un estat de restricció temporal sense que sigui detectat un estrès fisiològic en els cultius. Els cists temporals són cèl·lules atecades, envoltats pel pellicle, sense flagel i, per tant, no mòbils (fig. 3.2.2). La paret és més gruixuda que la teca de les cèl·lules vegetatives, sense ornamentació i manca de cel·lulosa, ja que es tenyeixen dèbilment amb el calcofluor. No hi ha un patró de plaques discernible en les formes temporals. Els cists temporals formats en cultius de laboratori tenen diferents morfologies i mides: coccoides (40-33 µm), ovoides (42-26 µm), esfèrics (35 µm) i bilobats. A la natura observem formes coccoides i bilobades en cists temporals vells. Els continguts del cists temporals són iguals als protoplasmes de les cèl·lules vegetatives amb nombrosos cloroplasts distribuïts per la cèl·lula i un nucli en forma d'U en la mateixa posició que les cèl·lules vegetatives. Mentre els cists temporals són joves, conserven pigmentació de clorofil·la (fig. 3.2.2), però quan envelleixen perden aquesta fluorescència, encara que mantenen una coloració bruna d’altres pigments. Tant en la natura com en els cultius, els cists temporals apareixen agrumollats en diferents superfícies. Al camp apareixen agrumollats a superfícies diverses (plàstics, trossos d'algues) i en els cultius apareixen enganxats a les parets dels flacons a l'interfase líquid-aire i, quan la seva concentració és alta, formen un núvol dens prop del fons.

Els cists temporals es divideixen mitjançant la partició del citoplasma (fig. 3.2.2) en dues, quatre i fins vuit cèl·lules, i mantenen el pellicle fins que se separen. Els cists temporals en cultiu també poden formar una teca nova i flagell per donar una cèl·lula vegetativa sense necessitat de dividir-se, sobretot en les formes bilobades que pràcticament conserven la forma de la cèl·lula vegetativa excepte en el fet que no tenen el cíngol tan marcat. L’alliberament de cèl·lules nedadores es dóna en cultius sense canviar les condicions ambientals, on estan en períodes de dies. Deixen el pellicle enganxat a la paret del recipient amb una marca rodona (forat), que és per on surt la cèl·lula.

La formació dels cists temporals en el camp es dóna principalment al vespre i les primeres hores de la nit (1-2 hores abans de la posta de sol), en què la majoria de les cèl·lules vegetatives en la columna d'aigua disminueix considerablement pel fet d'una marcada migració (fig. 3.2.4)

Els gamets i planozigots varen ser observats en la fase estacionaria de cultius vius. El gamets són cèl·lules petites de forma gymnodiniod (20 µm de llargada) i no presenten patró de plaques. Es varen observar parelles d'isogamets, amb un flagel longitudinal cadasqú. Les parelles nedaven amb un patró helicoidal. Els planozigots són cèl·lules grans (43-50 µm de diametre), amb patró de plaques i dos flagels (Fig 3.2.2. e).

La freqüència de cèl·lules en divisió in situ va ser estimada a partir dels diferents continguts de DNA en el temps (cicles diaris). L'histograma típic del contingut de DNA es presenta en la figura 3.2.5 on s'observen els percentatges de les fases cel·lulars d'A. taylori: G1, S i G2.

La freqüència de cèl·lules en divisió in situ va ser estimada a partir dels diferents continguts de DNA en el temps (cicles diaris) (fig. 3.2.5 a,c).

El ritme en les fases de la divisió cel·lular d'A. taylori permet aplicar el model de creixement proposat perquè permet l'estimació de la durada d'aquestes fases. L'A. taylori va mostrar un pic de duplicació del DNA (S) entre 3 i 4 hores després del període de foscor (1995 i 1996, respectivament) i un pic de divisió cel·lular (G2M) a la matinada, unes hores després de la sortida del sol en ambdós cicles. La durada de la fase S i la fase G2M s'estima entre 3.26 ± 0.8 hores i 3.14 ± 1 hores, respectivament.

Els resultats de les mesures relatives del contingut de DNA dels cists temporals i les cèl·lules vegetatives per microcitometria mostren els diferents continguts per als diferents estats cel·lulars (taula 3.2.1). Les cèl·lules vegetatives presenten una síntesi de DNA en uns períodes restringits dins del fotocicle, i llavors les cèl·lules tenen un contingut de DNA i un contingut doble que correspon a la replicació dels àcids nucleics (S) i el "gap" abans de la divisió cel·lular (G2). El contingut de DNA dels cists temporals és quasi el doble (1.8) del contingut de les cèl·lules vegetatives en fase G1.

DISCUSSIÓ

Els dos estats no mòbils en el cicle de vida de l'A. taylori (els cists de resistència i els cists temporals) es diferencien clarament per les característiques morfològiques. Encara que no hi ha grans diferències en els continguts cel·lulars de les cèl·lules vegetatives i els cists temporals, les diferents parets que envolten les cèl·lules (la teca i el pellicle) ajuden a la identificació principalment en les mostres de camp. Els cists temporals en l'A. taylori no mostren un patró en la paret més externa a diferència dels cists de l'A. ostenfeldii (Østergaard i Moestrup, 1997) que es poden tenyir amb calcofluor i revelen un patró concret.

Els estats sexuals en els cicle de vida de l'A. taylori, els gamets i planozigots es varen observar en cultius vius de la soca AV8. No s'ha observat, però, la formació dels cists de resistència per part d'aquest planozigots durant un mes. Els cists de resistència es varen obtenir de la població natural i són probablement el resultat de la reproducció sexual. Els cists de resistència s'han descrit en diverses espècies d'Alexandrium, com en A. monilatum (Walker i Steidinger, 1979), A. catenella (Fukuyo, 1985), A. cohorticula (Fukuyo i Pholpunthin, 1990a), A. affine (Fukuyo, 1985) i A. leii (Fukuyo i Pholpunthin, 1990b).

Encara que la ciclosi nuclear s'ha descrit com una característica general de la meiosi en les dinoflagel·lades, no s'ha observat el fenomen ni en les cèl·lules vegetatives ni en els cists temporals d'A. taylori. La ciclosi nuclear s'ha descrit en varies espècies de dinoflagel·lades com l'A. hiranoi, en Amphidinium klebssi (Barlow i Triemer, 1988) durant les divisions dels cists temporals en Gyrodinium instriatum i en Gyrodinium cohnii (Biecheler, 1952) com també s'ha descrit en el Ceratium horridum, C. cornutum, Oxyrrhis marina, Gymnodinium escavatum, G.paradoxum i Helgolandinium subglobosum (von Stosch, 1972) i G.pseudopalustre i Woloszynskia apiculata (von Stosch, 1973).Per tant, si considerem la ciclosi com un marcador morfològic associat amb la meiosi, no podem associar les divisions tant de les cèl·lules vegetatives com dels cists temporals a processos meiòtics. Tot i això, no es descarten processos sexuals en aquestes divisions o en d'altres tipus cel·lulars del cicle biològic ja que el patró de la meiosi en dinoflagel·lades varia considerablement en els seus cicles: en les cèl·lules mòbils, en cists temporals, en planozigots, en hipnozigots i en planomeiocits (von Stosch, 1973). El coneixement sobre el nivell de poliplodia en els estats cel·lulars com els cists temporals, els gamets, planozigots i els cists de resistència ajudarien a reconèixer la meiosi en el cicle de vida de les dinoflagel·lades. El contingut relatiu de DNA en els cists temporals de l'A. taylori (1.8 més gran que les cèl·lules vegetatives) pot ser interpretat com una duplicació dels àcids nucleics abans de la divisió cel·lular que presenta aquest estat.

Les formes cel·lulars i els processos de divisió descrits suggereixen el cicle biològic de l'A. taylori com es representa en la fig 3.2.7. La descripció proposada per al cicle de vida de l'A. taylori és similar a altres espècies en el gènere Alexandrium spp. Les cèl·lules vegetatives són les cèl·lules planctòniques o nedadores, donen lloc als cists temporals (cèl·lula bèntica) i a l'inrevés. Les divisions cel·lulars es donen tant en les cèl·lules vegetatives com en els cists temporals. El patró de divisió per a A. taylori és semblant al ja descrit en altres dinoflagel·lades i en espècies del gènere Alexandrium com ara en A. tamarense (Turpin et al., 1978).El procés de divisió vegetativa en fase permet conèixer la taxa de creixement in situ per al cicle cel·lular. S'ha mesurat un creixement actiu de les cèl·lules vegetatives en el camp en el període mostrejat a altes temperatures (26-28 ºC). Això està d'acord amb els resultats dels cultius de laboratori, en què les temperatures per sobre de 20 ºC són favorables per al creixement (capítol 3.3) i amb els resultats de camp on les màximes densitats cel·lulars d'A. taylori s'aconsegueixen amb temperatures de 23 a 27 ºC.

Les cèl·lules vegetatives produeixen per ècdisi els cists temporals. El procés d'ècdisi presentat es dóna en algunes espècies de gonyaulacoids i peridinoids com l'Heterocapsa, Gonyaulax, Scripsiella (Taylor, 1987) en resposta a l’estrès ambiental i/o a la formació de cists. Els cists temporals s'han descrit en el mateix gènere com a A. hiranoi (Kita et al., 1985, Kita et al., 1993), A. tamarense (Anderson i Wall, 1978, Doucette et al., 1989, Fritz et al., 1989), A. ostenfeldii (Østergaard i Moestrup, 1997) i en A. pseudogonyaulax (Montresor, 1995).S'han descrit també en altres gèneres com Ceratium (Chapman et al., 1982), Amphidinium (Sampayo, 1985, Barlow i Triemer, 1988) i en el gènere Disodinium i Pyrocystis (Elbrächter i Drebes, 1978). Sembla, doncs, que les formes temporals en el grup de les dinoflagel·lades no són tan extraordinàries, però les causes que disparen la formació de cists temporals de cèl·lules vegetatives mòbils i al revés no estan clares. S’han descrit condicions d’estrés com ara manca de nutrients específics en la formació d’aquestes cèl·lules en A. tamarense, (Doucette et al., 1989) i també controls fins de les condicions ambientals com ara canvis de la temperatura, com en Gonyaulax excavata (Schmitter, 1979) i Prorocentrum minimum (Grzebyk i Berland, 1996). La formació de cists temporals en A. taylori aparentment no respondria a condicions desfavorables nutricionals, sinó que quedaria més associat a cicles diaris i/o programació interna cel·lular. La població vegetativa i els estats bentònics de cists segueixen un cicle diari, almenys en el camp, on les fluctuacions en les condicions ambientals actuen com a marcadors per als ritmes diaris. Llavors en A. taylori, l'estat temporal de restricció podria ser part del cicle biològic de l'organisme, específicament del procés de divisió en associació amb cicles diaris, més que no pas una resposta específica a l'estrès ambiental de la població.

Els cists temporals formen agregats en el sediment de la platja. La formació d'agregats s'ha de donar per adhesió de les mateixes cèl·lules perquè no s'ha observat la producció de moc o exopolimers que englovin aquests agregats. Es poden trobar exemples en la literatura de l'encistament gregari en les dinoflagel·lades (Lombard i Capon, 1971, Horstmann, 1980) en llocs en que la difusió és alta com àrees de marea i estuaris. Els mecanismes d'agregació en fitoplancton no són ben coneguts, així, en un futur seria interessant establir relcions entre l'agregació cel·lular i diferents factors com l'estat de creixement de les algues i les condicions ambientals.

Després de l'ècdisi, les cèl·lules estan envoltades pel pellicle. El pellicle ja és present en les cèl·lules vegetatives d'A. taylori, ja que és molt fàcil que en males fixacions, les cèl·lules perdin la teca i quedin envoltades per aquesta paret més interna. El pellicle però pot estar present en diferents estats cel·lulars depenent de l'espècie. En Scripsiella trochoidea, el pellicle es forma en la cèl·lula vegetativa que es divideix (Morrill i Loeblich III, 1981), en Heterocapsa niei es forma després de l'ècdisi (Morrill i Loeblich III, 1984, Höhfeld i Melkonian, 1992) i en Amphidinium rhyncocephaylum és ja present en les cèl·lules vegetatives (Höhfeld i Melkonian, 1992). Una de les característiques del pellicle en els cists temporals d’A. pseudogonyaulax (Montresor, 1995) és la resistència a l’acetòlisi. També, en altres espècies de dinoflagel·lades com Peridinium spp. i Heterocapsa spp., el pellicle es caracteritza per la resistència a l'acetòlisi i la poca permeabilitat amb algunes excepcions com en espècies d'Alexandrium i Gonyaulax (Morrill i Loeblich III, 1981). En el cas de l'A. taylori, s'ha aconseguit una alta permeabilitat del pellicle amb fixacions de cists temporals en metanol i això ha permès la tinció dels nuclis. El metanol podria, doncs, permeabilitzar aquesta paret cel·lular i això permetria una millor entrada dels fluorocroms per als estudis del contingut de DNA en aquest tipus de cèl·lules. El contingut relatiu de DNA en els cists temporals d'A. taylori (1.8 vegades més gran que les cèl·lules vegetatives) pot ser interpretat com una duplicació dels àcids nucleics abans de la divisió cel·lular. En aquest cas, la durada d'aquesta fase podria ser llarga en relació a la divisió.

Les divisions dels cists temporals que s'han observat en l'A. taylori s'han descrit també en diverses espècies com en l'A. pseudogonyaulax (Montresor, 1995), en Amphidinium klebsii (Barlow i Triemer, 1988), on s'han observat fins a 8 cèl·lules, en el Glenodinium foliaceum (Silva i Faust, 1995) de 2 a 16 divisions, i en l'Amphidinium carterae (Sampayo, 1985) s'han descrit divisions de 6 a 8 cèl·lules. La divisió dels cists temporals permet conèixer en quin grau aquest estat pot contribuir al creixement total de la població, encara que aquest percentatge sigui menor comparat amb la taxa de creixement vegetatiu. D'acord amb això, el creixement en A. taylori és el resultat de la divisió de cèl·lules vegetatives i la germinació o divisió dels cists temporals.

Conceptualment, altres processos, apart de la divisió de les cèl·lules vegetatives i els cists temporals, prenen part en el creixement global de la població. Per exemple l'intercanvi entre cèl·lules vegetatives i cists temporals, que el podem anomenar encistament i excistament pendria part en la dinàmica de creixement de la població. El proper capítol es dirigirà a les condicions de l'encistament i germinació dels cists temporals que determinen el cost del manteniment de la població.